Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-53:2022 về xác định vi khuẩn ORT bằng phương pháp reatime PCR như thế nào?

Nội dung chính

• Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-53:2022 về xác định vi khuẩn ORT bằng phương pháp reatime PCR như thế nào?
• Phân lập vi khuẩn trong nuôi cấy, phân lập vi khuẩn ORT ra sao?
• Xác định hình thái vi khuẩn ORT như thế nào?

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-53:2022 về xác định vi khuẩn ORT bằng phương pháp reatime PCR như thế nào?

Tại Phụ lục E quy định xác định vi khuẩn ORT bằng phương pháp reatime PCR kèm theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-53:2022 có nêu:

(1) Nguyên liệu cho phương pháp realtime PCR

- Realtime PCR master mix [8]);

- Cặp mồi (primers) và mẫu dò (probe): xem Bảng 3;

- Nước tinh khiết không có nuclease;

- Dung dịch đệm TE

(2) Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra: là bệnh phẩm nghi mắc bệnh ORT (xem 7.2.1) hoặc là canh khuẩn, khuẩn lạc vi khuẩn ORT nghi ngờ (xem 7.2.2).

Mẫu đối chứng dương: là chủng vi khuẩn đã được xác định là ORT hoặc sử dụng các chủng ORT chuẩn.

Tách chiết ADN

Tách chiết ADN của vi khuẩn ORT bằng kít thương mại: Các bước tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kít tách chiết ADN của hãng Qiagen (DNeasy Blood & Tissue Kit, Catalog number: 69504); Kít tách chiết ADN của hãng Invitrogen (PureLink™ Genomic DNA Mini Kit, Catalog number: K182002) [9]).

Tách chiết ADN của vi khuẩn ORT bằng phương pháp sốc nhiệt: Lấy từ 2 khuẩn lạc đến 3 khuẩn lạc, hòa vào 200 pl nước vô trùng không chứa nuclease. Đun sôi cách thủy trong 10 min rồi làm lạnh nhanh huyễn dịch trong đá 5 min. Ly tâm huyễn dịch bằng máy ly tâm (5.4) với gia tốc 12 000 g trong 4 min. Thu hoạch phần trong phía trên để thực hiện phản ứng PCR.

(3) Chuẩn bị mồi (primers) và mẫu dò (probe)

Mồi/mẫu dò được chuẩn bị như sau:

- Chuẩn bị mồi/mẫu dò gốc: Mồi/mẫu gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm (5.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên.

Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (E.1.4) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM/µl làm mồi gốc;

- Chuẩn bị mồi sử dụng ờ nồng độ 20 µM/µl; mẫu dò sử dụng ở nồng độ 10 µM/µl: Pha loãng mồi gốc/mẫu dò gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (E.1.3).

VÍ DỤ: Pha mồi sử dụng lấy 20 µl mồi gốc có nồng độ 100 µl và thêm 80 µl nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 20 µM/µl; Pha mẫu dò sử dụng lấy 10 µl mồi gốc có nồng độ 100 µl và thêm 90 µl nước sẽ được mồi sử dụng có nồng độ 10 µM/µl.

(4) Cách tiến hành

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (xem E.3). Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml.

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit nhân gen QuantiTect Probe PCR kit, code: 204343 [10]).

Bảng E.1 - Thành phần của phản ứng realtime PCR xác định vi khuẩn ORT

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

- Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl mẫu ADN của vi khuẩn ORT vào ống phản ứng;

- Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng;

- Mẫu kiểm tra: Cho 5 µl mẫu ADN cần kiểm tra vào ống phản ứng.

LƯU Ý: Phản ứng Realtime PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng Realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng bằng máy realtime PCR (5.6) với chu trình nhiệt như nêu trong Bảng E.2.

Bảng E.2 - Chu trình nhiệt xác định vi khuẩn ORT

(5) Đọc kết quả

Đọc kết quả phản ứng bằng máy Reatime PCR dựa trên giá trị Ct (thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền).

Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương tính có giá trị Ct biết trước (± 2 giá trị Ct), mẫu đối chứng âm tính không có Ct;

- Mẫu kiểm tra dương tính khi giá trị Ct ≤ 35;

- Mẫu kiểm tra âm tính khi không có giá trị Ct;

- Mẫu kiểm tra nghi ngờ khi có giá trị 35 < Ct ≤ 40.

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại theo quy trình hoặc bằng phương pháp khác để khẳng định.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-53:2022 về xác định vi khuẩn ORT bằng phương pháp reatime PCR như thế nào? (Hình ảnh Internet)

Phân lập vi khuẩn trong nuôi cấy, phân lập vi khuẩn ORT ra sao?

Tại tiểu mục 7.2 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-53:2022 quy định về phân lập vi khuẩn như sau:

Sau 24 h đến 48 h, kiểm tra kết quả nuôi cấy:

- Môi trường BHI: Ống môi trường ít đục, vi khuẩn ORT mọc yếu trong môi trường BHI.

- Trên thạch máu: Khuẩn lạc ORT không gây dung huyết, có màu trắng xám đến xám, đôi khi hơi đỏ sẫm, mặt lồi với bờ rõ ràng, có kích thước từ 1 mm đến 3 mm.

- Trên thạch sô-cô-la: Vi khuẩn ORT mọc tốt hơn so với nuôi cấy trên môi trường thạch máu. Khuẩn lạc ORT không gây dung huyết, có màu trắng xám đến xám, đôi khi hơi đỏ sẫm, mặt lồi với bờ rõ ràng, có kích thước từ 1 mm đến 3 mm.

- Trên thạch MacConkey: Vi khuẩn ORT không mọc.

Chọn khuẩn lạc nghi ngờ cấy vào môi trường BHI (4.2) hoặc thạch máu (4.3) hoặc thạch sô-cô-la (4.4) nuôi trong tủ ấm có bổ sung CO2 (5.1) để xác định hình thái vi khuẩn, xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn, xác định vi khuẩn bằng phản ứng PCR hoặc realtime PCR.

Xác định hình thái vi khuẩn ORT như thế nào?

Tại tiểu mục 7.3 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-53:2022 quy định về xác định hình thái vi khuẩn ORT như sau:

Từ canh khuẩn hoặc khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn ORT (xem 7.2.2) tiến hành làm tiêu bản:

- Từ khuẩn lạc: Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý (4.13) lên phiến kính (5.17), dùng que cấy (5.14) lấy khuẩn lạc hòa đều vào giọt nước muối sinh lý.

- Từ canh khuẩn (BHI đã nuôi cấy vi khuẩn): Dùng que cấy (5.14) lấy một vòng canh khuẩn dàn mỏng lên trên phiến kính (5.17).

Tiêu bản được để khô và cố định trên ngọn lửa đèn cồn;

Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm Gram (xem Phụ lục A);

Soi tiêu bản thấy vi khuẩn ORT bắt màu đỏ hoặc đỏ hồng (màu của Gram âm), đa hình thái (hình tròn, hình trứng, hình que).