Dung dịch đệm TAE có được sử dụng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm khi có triệu chứng nhiễm bệnh hay không?

Nội dung chính

• Dung dịch đệm TAE có được sử dụng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm khi có triệu chứng nhiễm bệnh hay không?
• Dung dịch đệm TAE được tạo nên từ những thành phần nào? Cách điều chế dung dịch đệm TAE được thực hiện ra sao?
• Sử dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm thì cần những thiết bị dụng cụ nào?

Dung dịch đệm TAE có được sử dụng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm khi có triệu chứng nhiễm bệnh hay không?

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định về thuốc thử và vật liệu thử dùng khi tôm nhiễm bệnh vi bào tử như sau:

"3 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung

3.1.1 Etanol, từ 96 % đến 100 % (C2H6O)

3.1.2 Dung dịch đệm muối phosphat (PBS)

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR và Realtime PCR

3.2.1 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược.

3.2.2 Cặp mồi, Dò (Probe)

3.2.3 Kít tách chiết ADN (Xem B1 và B2).

3.2.4 Kít nhân gen (PCR Master Mix Kit, Cat. No K0171).

3.2.5 Kít nhân gen realtime PCR (Ví dụ: Kit Platinum® Quantitative PCR SuperMix-UDG, Cat.No: 11730-017).

3.2.6 Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) hoặc TBE (Tris-acetate - EDTA) (xem A.1).

3.2.7 Chất nhuộm màu (Ví dụ: Sybr safe).

3.2.8 Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X)

3.2.9 Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.10 Thang chuẩn ADN (Ladder)

3.2.11 Nước tinh khiết, không có nuclease

3.2.12 Agarose

3.3 Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

3.3.1 Formalin, dung dịch 10 % (thể tích)

Chuẩn bị từ dung dịch formaldehyde 38 % và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) hoặc nước cất (tỷ lệ thể tích 1:9).

3.3.2 Xylen

3.3.3 Dung dịch Davidson (xem A.2).

3.3.4 Thuốc nhuộm Haematoxylin (xem A.3)

3.3.5 Thuốc nhuộm Eosin (xem A.4).

3.3.6 Parafin, có độ nóng chảy từ 56 °C đến 60 °C.

3.3.7 Keo dán lamen"

Theo tiêu chuẩn vừa nêu trên thì đung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) nằm trong số những loại thuốc thử, vật liệu thử để chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm thông qua phương pháp PCR.

Dung dịch đệm TAE có được sử dụng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm khi có triệu chứng nhiễm bệnh hay không? (Hình từ Internet)

Dung dịch đệm TAE được tạo nên từ những thành phần nào? Cách điều chế dung dịch đệm TAE được thực hiện ra sao?

Theo Phụ lục A Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định về thành phần và phương pháp điều chế dung dịch đệm TAE như sau:

"A.1 Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.1.1 Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml

Nước khử ion: 900 ml

Tổng: 1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.1.2 Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2 Dung dịch Davidson

A.2.1 Thành phần

Etanol (95%); 330 ml

Formalin: 220 ml

(dung dịch nước bão hòa khí formaldehyde là dung dịch từ 36 % đến 38 %)

Axit acetic: 115 ml

Nước cất: 355 ml

A.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan axit acetic, formalin và etanol trong 355 ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.3 Thuốc nhuộm Hematoxylin (dung dịch Hematoxylin - Mayer)

A.3.1 Thành phần

Hematoxylin dạng tinh thể: 4g

Natri iodat: 0,8 g

Amoni alum sulphate [NH4Al(SO4)2]: 100 g

(hoặc Postasium alum sulphate [KAl(SO4)2])

Axit citric: 4g

Cloral hydrat: 200 g

Nước: 2000 ml

A.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan Hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni nhôm Sulfat hoặc kali nhôm Sulfat, hòa tan, tiếp tục cho axit citric và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.4 Thuốc nhuộm Eosin

A.4.1 Thành phần

Eosin Y: 10 g

Etanol 70 %: 1 lít

Axit axetic: 5 ml

A.4.2 Chuẩn bị

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 %. Hoà tan eosin trong etanol, sau đó thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị trong chai tối màu.

A.5 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.5.1 Thành phần

Natri clorua (NaCl) 8 g

Natri hydro photphat dihydrat (Na2HPO4.2H2O) 2,9 g

Kali dihydro photphat (KH2PO4) 0,2 g

Kali clorua (KCl) 0,2 g

Nước cất 1000 ml

A.5.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên vào 1000ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min."

Như vậy, thành phần của dung dịch đệnh TAE bao gồm: dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml, nước khử ion: 900 ml.

Để tạo nên dung dịch đệm TAE cần lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều sau đó bảo quản ở nhiệt độ phòng.

Sử dụng phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh vi bào tử ở tôm thì cần những thiết bị dụng cụ nào?

Theo Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-12:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 12:Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm quy định về thiết bị và dụng cụ dùng trong phương pháp PCR như sau:

"4 Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR, Realtime PCR

4.1.1 Máy nhân gen PCR

4.1.2 Máy Realtime PCR

4.1.3 Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g

4.1.4 Máy lắc trộn vortex

4.1.5 Máy ly tâm nhanh spindown

4.1.6 Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di

4.1.7 Máy đọc gel

..."

Theo đó, thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp PCR bao gồm:

- Máy nhân gen PCR

- Máy Realtime PCR

- Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g

- Máy lắc trộn vortex

- Máy ly tâm nhanh spindown

- Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di

- Máy đọc gel.