Kết quả điện di sản phẩm khi áp dụng phương pháp realtime PCR để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae gây ra ở cá cho kết quả như thế nào thì có thể kết luận cá nhiễm bệnh?

Nội dung chính

• Bước điện di sản phẩm khi áp dụng phương pháp realtime PCR để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae gây ra ở cá thực hiện như thế nào?
• Kết quả điện di sản phẩm khi áp dụng phương pháp realtime PCR để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae gây ra ở cá cho kết quả như thế nào thì có thể kết luận cá nhiễm bệnh?
• Để hỗ trợ thực hiện phương pháp realtime PCR để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae gây ra thì cần dùng thiết bị, dụng cụ nào?

Bước điện di sản phẩm khi áp dụng phương pháp realtime PCR để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae gây ra ở cá thực hiện như thế nào?

Theo điểm D3 Phụ lục D Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-21:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá quy định về điện di sản phẩm realtime PCR như sau:

D.3 Điện di sản phẩm realtime PCR

- Chuẩn bị thạch 1,5 %: cho 1,5 g agarose (3.2.8) vào lọ thủy tinh chịu nhiệt, bổ sung thêm 100 ml TBE 0,5X, đun dung dịch thạch trong lò vi sóng và mang ra lắc nhẹ sau mỗi 30 giây cho đến khi thạch tan hoàn toàn. Mang lọ thạch ra khỏi lò vi sóng và đợi đến khi nhiệt độ thạch bên trong lọ giảm xuống còn khoảng 50 °C.

- Cho 2,5 μl Gelred (3.2.9) vào 25 ml thạch 1,5 % (thể tích này sử dụng cho 17 giếng hoặc 25 giếng) và lắc đều nhẹ nhàng để Gelred hòa tan hoàn toàn, tránh tạo bọt khí. Sau đó đổ thạch vào khuôn đã có gắn sẵn lược, chờ khoảng 1 giờ để thạch đông.

- Khi bản thạch đã đông, nhẹ nhàng lấy lược ra và tránh làm vỡ thạch. Đặt thạch vào bồn điện di có chứa dung dịch TBE 1X, phải đảm bảo dung dịch TBE ngập khỏi bản thạch.

- Các sản phẩm PCR được pha với dung dịch loading dye 6X (3.2.10). Sau đó cho hỗn hợp này vào giếng thạch.

- Hút 7 μl thang chuẩn cho vào giếng cuối cùng.

- Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V đến 100 V.

- Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa bỏ thuốc nhuộm bằng cách ngâm trong nước 45 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV, chụp ảnh

Theo đó, bước điện di sản phẩm khi áp dụng phương pháp realtime PCR để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae gây ra ở cá được thực hiện theo tiêu chuẩn nêu trên.

Điện di sản phẩm (Hình từ Internet)

Kết quả điện di sản phẩm khi áp dụng phương pháp realtime PCR để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae gây ra ở cá cho kết quả như thế nào thì có thể kết luận cá nhiễm bệnh?

Theo tiết 6.2.2.5 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-21:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá quy định về kết quả điện di sản phẩm như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phát hiện vi khuẩn Streptococcus agalactiae

...

6.2.2.5 Điện di và đọc kết quả

Các bước tiến hành phản ứng tham khảo phụ lục D, D.3

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel theo bảng 2:

Đánh giá kết quả:

Điều kiện phản ứng được công nhận khi: kết quả của mẫu đối chứng dương (có giá trị Ct đã biết trước) phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct = ±2 Ct, mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct).

Với điều kiện như trên, mẫu dương tính là mẫu có giá trị Ct ≤ 35, sản phẩm sau khi chạy Realtime PCR tiếp tục điện di có kích thước vạch sáng 190 bp.

Mẫu âm tính là mẫu không có Ct hoặc mẫu có giá trị Ct ≤ 35 nhưng sản phẩm sau khi điện di không có vạch sáng hay vạch sáng không có kích thước 190 bp.

Mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 và sản phẩm sau khi chạy Realtime PCR tiếp tục điện di có kích thước vạch sáng 190 bp được coi là nghi ngờ.

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại hoặc sử dụng phương pháp khác để khẳng định.

Theo đó, kết quả điện di cho kết quả dương tính khi mẫu có giá trị Ct ≤ 35, sản phẩm sau khi chạy Realtime PCR tiếp tục điện di có kích thước vạch sáng 190 bp.

Mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 và sản phẩm sau khi chạy Realtime PCR tiếp tục điện di có kích thước vạch sáng 190 bp được coi là nghi ngờ.

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại hoặc sử dụng phương pháp khác để khẳng định.

Để hỗ trợ thực hiện phương pháp realtime PCR để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae gây ra thì cần dùng thiết bị, dụng cụ nào?

Theo Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-21:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá quy định về thiết bị dụng cụ dùng cho phương pháp realtime PCR như sau:

Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1 Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

4.1.1 Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0°C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

4.1.2 Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

4.1.3 Tủ ấm duy trì nhiệt độ ở 28 °C đến 30 °C;

4.1.4 Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g:

4.1.5 Nồi hấp vô trùng duy trì nhiệt độ 115 °C và 121 °C;

4.1.6 Cối, chày sứ, kéo, panh kẹp, que cấy vô trùng;

4.2 Thiết bị, dụng cụ của phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

4.2.1 Kính hiển vi quang học, vật kính 10X, 20X, 40X và 100X;

4.2.2 Máy định danh vi khuẩn hoặc thiết bị khác tương đương;

4.3 Thiết bị, dụng cụ của phương pháp PCR và Realtime-PCR

4.3.1 Máy tách chiết ADN/ARN tự động (nếu có);

4.3.2 Máy ly tâm;

4.3.3 Máy spindown;

4.3.4 Máy lắc ủ nhiệt;

4.3.5 Máy nhân gen (Realtime - PCR);

4.2.7 Thiết bị điện di: khay đổ thạch, bể điện di, máy đọc và chụp ảnh gel.

Như vậy, thiết bị dụng cụ dùng đễ thực hiện phương pháp realtime PCR gồm:

- Máy tách chiết ADN/ARN tự động (nếu có);

- Máy ly tâm;

- Máy spindown;

- Máy lắc ủ nhiệt;

- Máy nhân gen (Realtime - PCR);

- Thiết bị điện di: khay đổ thạch, bể điện di, máy đọc và chụp ảnh gel.

- Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0°C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

- Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

- Tủ ấm duy trì nhiệt độ ở 28 °C đến 30 °C;

- Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g:

- Nồi hấp vô trùng duy trì nhiệt độ 115 °C và 121 °C;

- Cối, chày sứ, kéo, panh kẹp, que cấy vô trùng.