Để thực hiện phương pháp nhuộm gram nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm cần chuẩn bị thành phần thuốc nhuộm ra sao?

Nội dung chính

• Cách lấy khuẩn lạc trong phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn được thực hiện ra sao?
• Phương pháp nhuộm gram khuẩn lạc để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính thực hiện ra sao?
• Để thực hiện phương pháp nhuộm gram nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm cần chuẩn bị thành phần thuốc nhuộm ra sao?

Cách lấy khuẩn lạc trong phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn được thực hiện ra sao?

Theo tiết 6.2.1.1 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm quy định về phân lập vi khuẩn như sau:

6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

…

6.2 Phát hiện bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm

6.2.1 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

6.2.1.1 Phân lập vi khuẩn

Dùng que cấy vô trùng cấy ria mẫu lên môi trường thạch TCBS (xem 3.2.1), ủ các đĩa thạch trong tủ ấm ở 28 °C đến 30 °C trong vòng 18 giờ đến 24 giờ.

Trên môi trường TCBS:

+ Khuẩn lạc phẳng, màu vàng, đường kính 2 mm - 3 mm: Vibrio cholerae, Vibrio fluvialis, Vibrio furnissii.

+ Khuẩn lạc phẳng, màu xanh lá, đường kính 2 mm - 3 mm: Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio mimicus.

Dùng que cây vô trùng, chọn khuẩn lạc điển hình (xanh, vàng) cấy ria trên môl trường thạch TSA (xem 4.2.2) 1 % NaCl (xem 4.2.3) ủ ở 28 °C đến 30 °C trong vòng 18 giờ đến 24 giờ. Lấy khuẩn lạc thuần thu được đi nhuộm gram và kiểm tra sinh hóa.

Theo đó, dùng que cấy vô trùng cấy ria mẫu lên môi trường thạch TCBS, ủ các đĩa thạch trong tủ ấm ở 28 °C đến 30 °C trong vòng 18 giờ đến 24 giờ.

Dùng que cây vô trùng, chọn khuẩn lạc điển hình (xanh, vàng) cấy ria trên môl trường thạch TSA 1 % NaCl ủ ở 28 °C đến 30 °C trong vòng 18 giờ đến 24 giờ. Lấy khuẩn lạc thuần thu được đi nhuộm gram và kiểm tra sinh hóa.

Để thực hiện phương pháp nhuộm gram nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm cần chuẩn bị thành phần thuốc nhuộm ra sao? (Hình từ Internet)

Phương pháp nhuộm gram khuẩn lạc để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính thực hiện ra sao?

Theo tiết 6.2.1.2 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm quy định về quy trình thực hiện phương pháp nhuộm gram như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

…

6.2 Phát hiện bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm

6.2.1 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

…

6.2.1.2 Quan sát hình thái, sử dụng phương pháp nhuộm Gram

Nhỏ một giọt nước muối sinh lý trên phiến kính, dùng que cấy vô trùng chuyển khuẩn lạc thuần trên môi trường TSA 1 % NaCl (xem 6.2.1.1) vào giọt nước rồi trộn đều, dàn mỏng, để khô tự nhiên sau đó cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn. Tiêu bản sau khi cố định được nhuộm bằng máy nhuộm gram tự động (nếu có) hoặc phương pháp gram (xem phụ lục B).

Soi trên kính hiển vi ở vật kính dầu với độ phóng đại 100 lần, vi khuẩn Vibrio bắt màu hồng (màu gram âm), hình que thẳng hoặc hơi cong, không hình thành bào tử và có tiên mao.

Theo Phụ lục B2 và B3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm quy địnH cách tiến hành nhuộm gram như sau:

B.2 Tiến hành nhuộm

- Nhỏ dung dịch tím lên tiêu bản: từ 1 phút đến 2 phút, rửa nước nhanh, để khô.

- Nhỏ dung dịch lugol: để 1 phút, rửa nước nhanh, để khô.

- Nhỏ cồn-axeton, rửa nước nhanh, để khô.

- Nhỏ dung dịch fucshin loãng: để 1 phút, rửa nước, thấm khô hoặc sấy khô.

B.3 Xem tiêu bản

- Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học bằng vật kính độ phóng đại 100 lần.

- Vi khuẩn gram dương bắt màu tím.

- Vi khuẩn gram âm bắt màu hồng.

Theo đó, nhỏ một giọt nước muối sinh lý trên phiến kính, dùng que cấy vô trùng chuyển khuẩn lạc thuần trên môi trường TSA 1 % NaCl vào giọt nước rồi trộn đều, dàn mỏng, để khô tự nhiên sau đó cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn.Tiêu bản sau khi cố định được nhuộm bằng phương pháp gram.

Nhỏ dung dịch tím lên tiêu bản: từ 1 phút đến 2 phút, rửa nước nhanh, để khô. tiếp đó nhỏ dung dịch lugol: để 1 phút, rửa nước nhanh, để khô, tiếp tục nhỏ cồn-axeton, rửa nước nhanh, để khô. Cuối cùng là nhỏ dung dịch fucshin loãng: để 1 phút, rửa nước, thấm khô hoặc sấy khô.

Sau khi hoàn thành các bước trên người thực hiện nhỏ thêm 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học bằng vật kính độ phóng đại 100 lần:

- Vi khuẩn gram dương bắt màu tím.

- Vi khuẩn gram âm bắt màu hồng.

Để thực hiện phương pháp nhuộm gram nhằm chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm cần chuẩn bị thành phần thuốc nhuộm ra sao?

Theo Phụ lục B1 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm quy định về thành phần tạo thuốc nhuộm gram như sau:

B.1 Thuốc nhuộm

B.1.1 Dung dịch kết tinh tím

Tím tinh thể 2,0 g

Ethanol 95% 20,0 ml

Amoni oxalat 0,8 g

Nước cất 80,0 ml

Hòa tan tím tinh thể trong etanol, hòa tan amino oxalat trong nước cất. Sau đó trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

B.1.2 Dung dịch fucshin đậm đặc

Basic fucshin 1 g

Ethanol 95% 10 ml

Phenol (axit phenic) 5 g

Nước cất 100 ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch fucshin theo tỉ lệ 1/10 với nước cất.

B.1.3 Dung dịch lugol

Kali iodua 2 g

Iodua tinh thể 1 g

Nước cất 200 ml Nghiền Kali iodua và iodua tinh thể. cho nước cất vào từ từ và lắc cho tan.

B.1.4 Cồn-axeton

Ethanol 95% 3 phần

Axeton 1 phần

Theo đó, thành phần sử dụng trong phương pháp nhuộm gram khuẩn lạc để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm gồm:

- Dung dịch kết tinh tím;

- Dung dịch fucshin đậm đặc;

- Dung dịch lugol;

- Cồn-axeton.