Nguyên liệu dùng cho việc xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh nhiễm trùng máu ở cá gồm những gì?

Nội dung chính

• Nguyên liệu dùng cho việc xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh nhiễm trùng máu ở cá gồm những gì?
• Khuẩn lạc dùng để xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila được chuẩn bị ra sao?
• Xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila bằng phương pháp phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn được thực hiện như thế nào?

Nguyên liệu dùng cho việc xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh nhiễm trùng máu ở cá gồm những gì?

Theo mục B.1 Phụ lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-15:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas Hydrophila ở cá quy định nguyên liệu dùng cho việc xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila như sau:

B.1. Nguyên liệu cho giám định sinh hóa

B.1.1. Môi trường nước pepton

Chuẩn bị môi trường nước pepton theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

B.1.2. Thuốc thử Kovac’s

B.1.2.1. Thành phần

Paradimetyl aminobenzaldehyt 5 g

Cồn amylic 75 ml

Axit clohydric đặc 25 ml

B.1.2.2. Chuẩn bị

Trộn dung dịch paradimetyl aminobenzaldehyt vào cồn amylic cho tan hết và để trong tủ lạnh. Thêm từ từ 5 ml đến 10 ml axit clohydric đặc, trộn đều rồi để tủ lạnh, sau đó tiếp tục bổ sung axit clohydric đặc.

Bảo quản thuốc thử trong lọ màu, ở 4 °C.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng thuốc thử Kovac's thương mại và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

B.1.3. Thuốc thử H2O2, 3 %.

B.1.4. Môi trường nước pepton - đường

B.1.4.1. Thành phần

- Nước pepton;

- Dung dịch chỉ thị màu bromocrezol: cho 0,2 g bromocrezol vào 100 ml etanol 90 % (thể tích) và lắc cho tan hết;

- Dung dịch đường: glucose, sucrose.

B.1.4.2. Chuẩn bị

Pha glucose hoặc sucrose thành dung dịch 10 % (trong nước), hấp tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp (4.1.5) ở 115 °C trong 15 min hoặc hấp cách quãng 3 lần ở 100 °C trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm.

Cho 0,1 ml chỉ thị màu bromocrezol vào 100 ml môi trường nước pepton, chia ra các ống (4 ml mỗi ống). Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp (4.1.5) ở 120 °C trong 30 min. Chỉnh pH môi trường ở 6,8 ± 0,2.

Thêm 0,4 ml dung dịch đường 10 % vào ống chứa 4 ml môi trường.

B.1.5. Môi trường thạch TSI (Tripie Sugar Iron agar)

Chuẩn bị môi trường thạch TSI (theo hướng dẫn của nhả sản xuất);

Thạch nghiêng chế từ TSI: thạch màu đỏ và có 2 phần: phần thạch đứng bên dưới để kiểm tra khả năng lên men glucose, sinh hơi, sinh H2S, phần thạch nghiêng để kiểm tra khả năng lên men đường lactose.

B.1.6. Môi trường thạch urê

Có thể sử dụng môi trường urê cơ bản (urea agar base - Christensen). Chuẩn bị môi trường và bổ sung urê theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

B.1.7. Môi trường thạch lỏng kiểm tra khả năng di động

B.1.7.1. Thành phần

Pepton 10 g

Chất chiết thịt 3 g

Natri clorua 5 g

Thạch 4 g

Gelatin 80 g

Nước cất 1000 ml

B.1.7.2. Chuẩn bị

Hòa gelatine vào nước để 30 min, bổ sung các thành phần khác, đun cho tan hoàn toàn. Chia ra các ống nghiệm khoảng 6 ml/ống. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (4.1.5) ở 115 °C trong 15 min.

B.1.8. Môi trường ornithine decacbolxylase

B.1.8.1. Thành phần

Pepton 0,5 g

Chất chiết nấm men 0,3 g

Glucose 0,1 g

Chỉ thị bromocresol đỏ tía 0,2 % 0,1 ml

L-ornithin clohydric 0,5 g

Nước 100 ml

B.1.8.2. Chuẩn bị

Hòa tan pepton, chất chiết nấm men, glucose trong nước, chỉnh môi trường về pH = 6,7 và thêm chất chỉ thị màu bromocresol đỏ tía 0,2 %. Hấp môi trường trong nồi hấp (4.1.5) ở 115 °C trong 15 min.

Bổ sung thêm L-ornithine hydrochloride 0,5%. Chỉnh lại pH môi trường về 6,7. Chia môi trường ra các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm khoảng 2 ml.

Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (4.1.5) ở 115 °C trong 15 min.

B.1.9. Môi trường OF

B.1.9.1. Thành phần

Thạch OF 1 g

Glucose 2 g

Nước cất 100 ml

B.1.9.2. Chuẩn bị

Hòa các thành phần trên vào lọ sạch, đun cho tan hoàn toàn.

Chia ra các ống nghiệm, mỗi ống 6 ml.

Hấp tiệt trùng trong nồi hấp (4.1.5) ở 115 oC trong 15 min.

B.1.10. Thuốc thử cho phản ứng Oxidase

Theo đó, nguyên liệu dùng để xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gồm:

- Môi trường nước pepton;

- Thuốc thử Kovac’s;

- Thuốc thử H2O2, 3 %.;

- Môi trường nước pepton - đường;

- Môi trường thạch TSI (Tripie Sugar Iron agar);

- Môi trường thạch urê;

- Môi trường ornithine decacbolxylase;

- Môi trường OF;

- Thuốc thử cho phản ứng Oxidase.

Nguyên liệu dùng cho việc xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh nhiễm trùng máu ở cá gồm những gì?

Khuẩn lạc dùng để xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila được chuẩn bị ra sao?

Theo tiết 6.1.4.1 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-15:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas Hydrophila ở cá quy định về phân lập vi khuẩn như sau:

6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Giám định Aeromonas hydrophila bằng phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn.

...

6.1.4.1. Phân lập vi khuẩn.

- Dùng que cấy chọc sâu xuống vị trí vô trùng ở mục (6.1.3) để lấy bệnh phẩm cấy trên môi trường thạch chọn lọc cho Aeromonas spp. Rimler-Shotts (R-S) (3.2.2).

- Ủ đĩa thạch đã cấy mẫu trong tủ ấm (4.1.4) từ 18 h đến 24 h. Trên môi trường thạch Rimler-Shotts khuẩn lạc có dạng tròn, lồi, nhẵn có màu vàng nhạt.

- Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào môi trường NA (3.2.1). Ủ trong tủ ấm (4.1.4) để kiểm tra hình thái và xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn. Trên môi trường NA, khuẩn lạc của Aeromonas hydrophila có dạng hình tròn, hơi lồi, nhẵn và có màu trắng đục

Như vậy quá trình phân lập vi khuẩn để chọn khuẩn lạc dùng trong việc xác định hình đặc tính sinh hóa của vi khuẩn được thực hiện theo Tiêu chuẩn trên.

Xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila bằng phương pháp phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn được thực hiện như thế nào?

Theo tiết 6.1.4.2 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-15:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas Hydrophila ở cá quy định về cách xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Aeromonas hydrophila bằng phương pháp phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn như sau:

6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Giám định Aeromonas hydrophila bằng phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn.

...

6.1.4.2. Xác định vi khuẩn.

6.1.4.2.1. Quan sát hình thái.

- Dùng que cấy lấy khuẩn lạc hòa đều vào giọt nước sinh lý trên phiến kính (4.1.1), dàn mỏng, để khô và cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn;

- Tiêu bản sau khi đã được cố định, nhuộm bằng phương pháp Gram (xem Phụ lục A);

- Aeromonas hydrophila bắt màu hồng (màu gram âm), hình que ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,5 µm x (từ 1,0 µm đến 1,5 µm).

6.1.4.2.2. Xác định đặc tính sinh hóa.

- Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống: Xác định vi khuẩn dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản: Vi khuẩn gram âm, oxidase dương tính, catalase dương tính và một số đặc tính sinh hóa đặc trưng được trình bày trong Bảng 1. Tiến hành các phản ứng sinh hóa (xem Phụ lục B).

- Định danh vi khuẩn bằng kít thương mại (ví dụ bộ kít API 20E): Xác định vi khuẩn dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản: Vi khuẩn gram âm, oxidase dương tính, catalase dương tính, O/F dương tính và các chỉ tiêu sinh hóa nêu trong Bảng 2. Tiến hành các phản ứng sinh hóa bằng bộ kít API 20E (tham khảo Phụ lục C).

6.1.4.3. Đọc kết quả.

Cá được xác định là nhiễm bệnh do Aeromonas hydrophila khi nuôi cấy, phân lập, định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống hoặc nuôi cấy, phân lập, định danh được Aeromonas hydrophila bằng bộ kít thương mại.

Theo đó việc định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila bằng phương pháp sinh hóa truyền thống được thực hiện bằng cách xác định vi khuẩn dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản (vi khuẩn gram âm, oxidase dương tính, catalase dương tính và một số đặc tính sinh hóa đặc trưng được trình bày trong Bảng 1).

Cá được xác định là nhiễm bệnh do Aeromonas hydrophila khi nuôi cấy, phân lập, định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống.