Những loại dung dịch thuốc thử nào dùng trong phương pháp mô học cần phải tiến hành điều chế? Thực hiện chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bằng phương pháp mô học như thế nào?

Nội dung chính

• Cần chuẩn bị những loại thuốc thử nào khi thực hiện phương pháp mô học để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm?
• Những loại dung dịch thuốc thử nào dùng trong phương pháp mô học cần phải tiến hành điều chế?
• Thực hiện chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bằng phương pháp mô học như thế nào?

Cần chuẩn bị những loại thuốc thử nào khi thực hiện phương pháp mô học để chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm?

Theo tiết 3.2.2 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định về thuốc thử, vật liệu thử, thiết bị dụng cụ cần thiết khi chẩn đoán như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.2. Phương pháp mô học

3.2.2.1. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có RNAase, trừ khi có quy định khác.

- Dung dịch Davidson (xem A.1).

- Thuốc nhuộm hematoxylin (xem A.2).

- Thuốc nhuộm eosin (xem A.3).

- Etanol 70 %, 90 % và etanol tuyệt đối.

- Parafin.

- Xylen.

- Keo dán, ví dụ Bom Canada.

Theo đó, người tiến hành chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bằng phương pháp mô học cần chuẩn bị dung dịch Davidson; thuốc nhuộm hematoxylin; thuốc nhuộm eosin; Etanol 70 %, 90 % và etanol tuyệt đối; Parafin; Xylen; Keo dán.

Thực hiện chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bằng phương pháp mô học như thế nào? (Hình từ Internet)

Những loại dung dịch thuốc thử nào dùng trong phương pháp mô học cần phải tiến hành điều chế?

Theo Phụ lục A TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định về thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử như sau:

"A.1. Dung dịch Davidson

Etanol 95 % 330 ml

Formalin (formaldehyd 37 %) 220 ml

Axit axetic đậm đặc 115 ml

Nước 335 ml

A.2. Thuốc nhuộm hematoxylin (dung dịch hematoxylin - Mayer)

Hematoxylin dạng tinh thể 1 g

Natri iodat 0,2 g

Amoni alum [NH4Al(SO4)2] hoặc kali alum [KAl(SO4)2]: 50 g

Axit axetic 1 g

Cloral hydrat 50 g

Nước 1000 ml

Hòa tan hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni alum hoặc kali alum, hòa tan, tiếp tục cho axit axetic và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.3. Thuốc nhuộm eosin

Eosin Y 1 g

Etanol 70 % 1 lít

Axit axetic băng 5 ml

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 %. Hòa tan eosin trong etanol, sau đó cho thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.4. Dung dịch R-F (RNA - friendly)

Formaldehyd 37 % 349 ml

Cồn 95 % 407 ml

Nước 244 ml

Chỉnh pH = 7."

Theo đó, có 04 loại dung dịch thuốc thử dùng trong phương pháp mô học chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm cần phải chuẩn bị thành phần theo đúng quy định tại Phụ lục A TCVN 8710-8:2012 bao gồm: dung dịch Davidson; thuốc nhuộm hematoxylin; thuốc nhuộm eosin; dung dịch R-F.

Thực hiện chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm bằng phương pháp mô học như thế nào?

Theo tiết 3.2.2.4 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-8:2012 về Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm quy định về cách tiến hành phương pháp mô học chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

3.2.2. Phương pháp mô học

...

3.2.2.4. Cách tiến hành

3.2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu

Cố định mẫu trong dung dịch Davidson. Đối với ấu trùng hoặc tôm hậu ấu trùng có thể cố định cả con trong dung dịch Davidson từ 12 h đến 24 h. Số tôm thu từ 30 con đến 50 con mỗi bể. Sau đó cố định trong etanol 70 % ở nhiệt độ phòng.

Đối với tôm lớn cố định bằng cách lấy tôm sống cắt lấy phần cơ đuôi, cơ bụng, sau đó cho vào lọ có chứa dung dịch Davidson. Số tôm thu từ 5 con đến 10 con một ao. Nếu mẫu lớn cần phải cắt nhỏ, chiều dài mẫu không quá 1 cm. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10, ngâm trong 24 h đến 72 h phụ thuộc vào kích thước của mẫu, sau đó bảo quản ngay trong etanol 70 % ở nhiệt độ phòng.

3.2.2.4.2. Khử mẫu cố định

Ngâm trong etanol 90 % hai lần, trong thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần. Sau đó ngâm trong etanol tuyệt đối hai lần, thời gian 30 min đến 60 min mỗi lần.

3.2.2.4.3. Làm trong mẫu

Ngâm sang lọ xylen 1 để trong 30 min đến 60 min.

Ngâm sang lọ xylen 2 để trong 30 min đến 60 min.

Sau đó ngâm tẩm parafin hai lần, mỗi lần 56 oC đến 58 oC trong 1 h.

Đúc khuôn: Đặt mẫu đã thấm parafin vào khuôn đổ parafin tập trung vào một mặt của khuôn để khi cắt được tốt hơn. Làm lạnh mẫu trong bàn lạnh hoặc để trong tủ lạnh.

3.2.2.4.4. Cắt mẫu

Cắt gọt khối block parafin vuông, mặt cắt bằng phẳng, để trên mặt khay đá.

Đặt mặt khối block parafin song song với mép lưỡi dao, cắt chiều dày lát cắt từ 4 m đến 5 m.

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng thả vào nồi nước nhiệt độ nước từ 30 oC đến 35 oC; sau đó dùng lam kính vớt lát cắt tiêu bản. Để khô.

3.2.2.4.5. Nhuộm tiêu bản H&E

Tẩy parafin bằng cách ngâm trong xylen hai lần, mỗi lần từ 3 min đến 5 min, sau đó ngâm lần lượt trong etanol tuyệt đối, etanol 90 % và etanol 70 %, mỗi lần ngâm từ 3 min đến 5 min rồi đem rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min.

Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin từ 3 min đến 5 min sau đó rửa dưới vòi chảy từ 3 min đến 5 min rồi tiếp tục ngâm trong thuốc nhuộm eosin từ 1 min đến 2 min.

Làm mất nước trong mẫu qua các thang nồng độ etanol 75 %, etanol 90% và etanol tuyệt đối, mỗi bước từ 1 min đến 2 min, chuyển sang xylen hai lần (mỗi lần từ 2 min đến 3 min), gắn lamen bằng keo dán, ví dụ Bom Canada. Để khô và soi kính.

3.2.2.4.6. Đọc kết quả

Soi tiêu bản từ độ phóng đại thấp đến độ phóng đại cao (100 X, 400 X, 1000 X)

Khi tôm bị bệnh IMNV, kết quả mô bệnh học cho thấy các vị trí hoại tử ở các sợi cơ vân và có hiện tượng viêm, phù, xuất huyết giữa các sợi cơ, xuất hiện thể ẩn trong tế bào chất.

Tôm bị nhiễm nặng, phần cơ ở bụng bị hoại tử nghiêm trọng và sự xâm nhập với số lượng lớn của các tế bào máu vào vùng bị viêm."

Như vậy, để tiến hành phương pháp mô học nhằm chẩn đoán bệnh ở tôm thì tiến hành theo các bước được quy định ở trên.