Những loại thuốc thử và vật liệu thử nào cần phải chuẩn bị khi thực hiện chẩn đoán bệnh còi ở tôm trên tôm giống bằng phương pháp RT PCR?

Nội dung chính

• Tôm giống có thể nhiễm phải bệnh còi ở tôm không và tỉ lệ chết khi nhiễm bệnh có thể lên đến bao nhiêu phần trăm?
• Phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh còi ở tôm được thực hiện dựa trên nguyên tắc nào?
• Những loại thuốc thử và vật liệu thử nào cần phải chuẩn bị khi thực hiện chẩn đoán bệnh còi ở tôm trên tôm giống bằng phương pháp RT PCR?

Tôm giống có thể nhiễm phải bệnh còi ở tôm không và tỉ lệ chết khi nhiễm bệnh có thể lên đến bao nhiêu phần trăm?

Theo tiểu mục 3.1 Mục 3 TCVN 8710-1:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 1: Bệnh còi do vi rút ở tôm quy định về triệu chứng lâm sàng ở tôm như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

3.1 Chẩn đoán lâm sàng

3.1.1 Dịch tễ học

Đặc điểm phân bố: MBV đã trở thành bệnh dịch động vật thủy sản trên các loài tôm thuộc họPeenaeidae.

Bệnh lây lan thông qua các cá thể bị nhiễm bệnh trong ao, bể do tôm ăn thức ăn có chứa mầm bệnh, do dụng cụ đựng thức ăn bị nhiễm hoặc qua vật chủ trung gian như copepoda, tôm, cua, ghẹ... hoặc các loài chim mang mầm bệnh MBV vào vùng nuôi.

Giai đoạn cảm nhiễm: tất cả các giai đoạn ngoại trừ trứng và ấu trùng Naupli, tỉ lệ cảm nhiễm từ 1 % trên tôm tự nhiên, có thể lên đến 100 % trong các trại sản xuất giống.

3.1.2 Triệu chứng lâm sàng

Giai đoạn ấu trùng biến thái (zoea, mysis) và giai đoạn đầu của tôm giống (postlarvae) bị cảm nhiễmMBV nặng có thể quan sát thấy ruột giữa có màu sắc nhợt nhạt, do sự xuất hiện của các thể ẩn và các mảnh vụn tế bào trong phân.

Tôm giống nhiễm nặng thường yếu, bơi lội lờ đờ, cơ thể đổi màu xanh lơ hay xanh đen, sinh trưởng chậm, chuyển giai đoạn không đều, tỉ lệ chết tích luỹ có thể lên đến 90 % nếu môi trường không ổn định.

Tôm thương phẩm thường phân đàn, có thể sau 3 tháng đến 4 tháng nuôi vẫn có kích thước rất nhỏ gọi là “tôm kim”.

Cơ quan kí sinh: tế bào biểu bì của cơ quan gan tụy và ruột giữa."

Theo đó, có thể thấy tôm giống cũng sẽ có thể nhiễm phải bệnh còi ở tôm, tình trạng tôm giống nhiễm bệnh nặng sẽ có triệu chứng lâm sàng như ruột giữa có màu sắc nhợt nhạt, do sự xuất hiện của các thể ẩn và các mảnh vụn tế bào trong phân.

Tôm giống nhiễm nặng thường yếu, bơi lội lờ đờ, cơ thể đổi màu xanh lơ hay xanh đen, sinh trưởng chậm, chuyển giai đoạn không đều,

Tỉ lệ chết khi tôm giống nhiễm phải bệnh còi ở tôm có thể lên đến 90% nêu môi trường không ổn định.

Những loại thuốc thử và vật liệu thử nào cần phải chuẩn bị khi thực hiện chẩn đoán bệnh còi ở tôm trên tôm giống bằng phương pháp RT PCR? (Hình từ Internet)

Phương pháp RT PCR để chẩn đoán bệnh còi ở tôm được thực hiện dựa trên nguyên tắc nào?

Theo tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-1:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 1: Bệnh còi do vi rút ở tôm quy định về phương pháp chẩn đoán bệnh ở tôm như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

3.2.1 Phương pháp PCR

3.2.1.1 Nguyên tắc

Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của ADN polymerase tổng hợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham ra của mồi, bốn loại gồm adenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP), cytocin (dCTP), dùng để khuếch đại đoạn ADN đích thông qua các chu kì luân nhiệt. Để thực hiện phản ứng khuếch đại ADN đích gồm 3 quá trình: biến tính, bắt cặp và kéo dài mạch, tổng hợp mạch ADN mới.

Phương pháp PCR tổ (nested PCR): là PCR có hai giai đoạn, giai đoạn đầu dùng cặp mồi ngoài (gọi là PCR vòng ngoài) để khuếch đại một đoạn ADN đích. Sau đó dùng sản phẩm PCR vòng ngoài này làm

khuôn cho vào ống PCR có cặp mồi trong (gọi là PCR vòng trong) để khuếch đại đoạn ADN trong đoạn ADN đích.

Như vậy, phương pháp RT PCR được thực hiện dựa trên hoạt động của ADN polymerase tổng hợp nên mạch mới từ mạch khuôn, có sự tham ra của mồi, bốn loại gồm adenin (dATP), thymin (dTTP), guanin (dGTP), cytocin (dCTP), dùng để khuếch đại đoạn ADN đích thông qua các chu kì luân nhiệt.

Những loại thuốc thử và vật liệu thử nào cần phải chuẩn bị khi thực hiện chẩn đoán bệnh còi ở tôm trên tôm giống bằng phương pháp RT PCR?

Theo tiết 3.2.1.2 tiểu mục 3.2 Mục 3 TCVN 8710-1:2011 về bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 1: Bệnh còi do vi rút ở tôm quy định về thuốc thử và vật liệu thử cần trong phương pháp RT PCR như sau:

"3. Phương pháp chẩn đoán

...

3.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

...

3.2.1.2 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước cóđộ tinh khiết tương đương không có ARNase, trừ khi có quy định khác.

- Dung dịch đệm TE (Tris - EDTA)

Chuẩn bị dung dịch chứa Tris [tris (hydroxymetyl) aminometan] 10 mM và EDTA 1 mM, dùng axitclohydric (HCl) để chỉnh pH 7,6.

- Dung dịch EDTA (etylen diamin tetra axetic) 0,5 M

Hòa tan 93,05 g EDTA trong 350 mL nước, chỉnh pH 8,0 bằng dung dịch NaOH nồng độ 4 M. Thêm nước cho đủ 500 mL. Hấp vô trùng ở 121 oC trong 15 min. Bảo quản ở nhiệt độ phòng

- Pha dung dịch TBE 1 X

Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần (Tris - axit boric - EDTA 10X)

Hòa tan 108 g Tris và 55 g axit boric trong 600 mL nước. Thêm 40 mL EDTA 0,5 M và thêm nước cho đủ 1 lít. Hấp vô trùng ở 121 oC trong 15 min, bảo quản ở nhiệt độ phòng. Khi sử dụng thêm 900 ml nước vào 100 ml dung dịch TBE gốc (10X) thành dung dịch 1X.

- Dung dịch đệm tải mẫu ADN đậm đặc 6 lần (loading dye 6X)

Chuẩn bị dung dịch gồm Tris-HCl 10 mM (pH 7,6); bromophenol blue 0,03 %; xylen xyanol FF 0,03 %; glycerol 60 % và EDTA 60 mM (sử dụng dung dịch EDTA 0,5 M). Bảo quản ở nhiệt độ -20 oC.

- Cồn 95 %

- Bộ Kít tách chiết ADN

- Thang chuẩn ADN (ADN marker) gồm có các thang 100 bp; 200 bp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 1000 bp.

- Etidi bromua (EtBr)

- Agaroza.

Theo đó, khi tiến hành chẩn đoán bệnh còi ở tôm bằng phương pháp RT PCR cần chuẩn bị những loại thuốc thử và vật liệu thử nêu trên.